Kapacitace

Kapacitace je označení maturačních změn spermie, které probíhají v pohlavním traktu samice u savců. Po ejakulaci je spermie neschopná oplodnění, k tomu je zapotřebí, aby určitou (pro každý druh specifickou) dobu pobývala v reprodukčním traktu samice, kde interaguje se složkami oviduktální tekutiny (např. sérový albumin, lipoproteinové komplexy, atd.) ^[1],^[2]

Kapacitace je často spojená s jevem nazývaným hyperaktivace. Spermie změní charakter svého pohybu, asymetricky se zvětší vlnění bičíku (spermie se pohybuje rychleji a v kruhu), hyperaktivace může pomáhat spermii odpoutat se z oviduktálního rezervoáru a proniknout vajíčkem ^[3]

Spermie nekapacitují všechny najednou, po určité minimální době inkubace v tekutinách oviduktu (nebo v kapacitačním mediu při kapacitaci in vitro) se ustanoví populace kapacitovaných spermií (od 1-10% z počtu spermií, závislé na druhu i konkrétním jedinci), která se po určité době (než se spermie vyčerpají) udržuje ^[4]

Kapacitované spermie, které se nepotkají s vajíčkem po krátké době umírají.

Kapacitační změny

Změny spojené s kapacitací lze rozdělit do tří skupin

na povrchu, změny v proteinovém obalu spermie
v cytoplazmatické membráně
v cytoplazmě

Změny na povrchu spermie

Během kapacitace dochází ke změnám v proteinovém složení povrchu spermií. Proteiny na povrchu spermií chrání spermii při průchodu samičím traktem a umožňují jí navázat se na stěnu oviduktu (vejcovodu) za vzniku oviduktálního reservoáru spermií. Díky tomuto rezervoáru se prodlouží životnost spermií v oviduktu a tím zvýší pravděpodobnost početí. V průběhu kapacitace spermie ztrácí schopnost vázat se na stěnu oviduktu.^[5]

Změny v cytoplazmatické membráně

Během kapacitace dochází k odstraňování cholesterolu z membrány, zvyšuje se fluidita (tekutost) membrány, po odstranění určitých inhibičních proteinů dochází k aktivaci některých iontových kanálů ^[6]
Dochází k porušení asymetrie složení membrány, fosfatidylethanolamin a fosfatidylserin se dostavávají do vnější vrstvy membrány.^[7],^[8]

Změny ve složení cytoplazmatické membrány vedou k destabilizaci membrány a tím připravují spermii na akrosomovou reakci a fúzi s vajíčkem

Změny v cytoplazmě

Během kapacitace dochází k signalizační kaskádě, která připravuje spermii na kontakt a fúzi s vajíčkem. Dochází ke zvýšení koncentrace cytoplazmatického Ca²⁺ ^[9], HCO₃⁻. Zvýšená koncentrace HCO₃⁻ vede ke zvýšení pH uvnitř spermie a zvýšení koncentrace cAMP pomocí HCO₃⁻ dependentní (závislé) adenylyl cyklázy ^[10]. cAMP pak mimo jiné aktivuje PKA. Konečným výsledkem je fosforylace tyrosinu některých cytoplazmatických proteinů.^[11] Aktivita adenyly cyklázy je také zvýšená některými reaktivními kyslíkovými radikály (ROS - reaktive oxygen species) jako H₂O₂ , O₂⁻ a NO^.
v cytoplazmě přítomný aktin G se pod vlivem HCO₃⁻ /cAMP/PKA (a částečně i PKC)/PLD signalizační dráhy začne polymerizovat na aktin F. Polymerizace aktinu vede k přesunu fosfolipázy C (PLC)z cytoplazmy do cytoplazmatické membrány. Během akrozomové reakce aktin F zpětně velmi rychle depolymeruje (umožní se tak kontakt cytoplazmatické membrány s vnější akrosomovou membránou) ^[12]

Výsledek kapacitace

Po skončení kapacitace je spermie připravená na oplození vajíčka. Kapacitované spermie:

vykazují schopnost chemotaxe a thermotaxe a díky tomu jsou schopné aktivně vyhledávát vajíčko.^[13],^[14]
jsou schopné navázat se na glykoproteinový obal vajíčka – zonu pellucidu a podstoupit akrosomovou reakci.^[15]
- po akrosmové reakci dojde k odhalení vnitřní akrosomové membrány, která obsahuje proteiny podílející se na fúzi spermie s vajíčkem ^[16]

Kapacitace in vitro

provedení

Pro různé studie mechanismů savčího oplození a pro asistovanou reprodukci je zapotřebí spermie kapacitovat in vitro. Podstatou je odstranění semenné plazmy (tekutiny, ve které jsou spermie po ejakulaci) např. centrifugací a inkubace spermií v tzv, kapacitačním mediu, které napodobuje fyziologickou tekutinu v oviduktu. Kapacitačních medií je celá řada, společným rysem je přítomnost: Ca²⁺ , HCO₃⁻, sérového albumínu, zdroje energie ( glukosa, fruktosa, laktát, pyruvát) a správná osmomolarita (~300 mOsmol/kg)

Tyrodovo medium - příklad složení kapacitačního media

látka	koncentrace
NaCl	96.0 mM
KCl	4.7 mM
MgSO₄	0.4 mM
NaH₂PO₄	0.3 mM
glukosa	5.5 mM
pyruvát	1.0 mM
laktát	21.6 mM
CaCl₂	0.5mM
NaHCO₃	10.0 mM
HEPES	20.0 mM

upravit pH připraveného roztoku na 7-7,5 a přidat 3mg BSA/ml (místo BSA je možno použít i jiné sérové albumíny příslušného druhu – např. HSA, PSA, ... )

Z ejakulátu se izolují spermie (např. centrifugací nebo swim up metodou) a rozředí se v kapacitačním mediu na koncentraci asi 3×10⁶ spermie/ml. Spermie se inkubují při 37-38 °C, v atmosféře 5% CO₂ (atmosféra obohacená CO₂ na 5%) a při 100% vlhkosti vzduchu po dobu, která je pro každý druh (i každého jedince) specifická (2-12 hod). Kapacitační stav spermií se vyhodnocuje pod mikroskopem. Nejčastějšími metodami jsou:

analýza videa (hodnotí se specifický charakter pohybu spermií)
indukce akrozomální reakce (pouze kapacitované spermie jsou schopné podstoupit akrozomální reakci)
chlortetracyklinová (CTC) esej - během kapacitace se změní vazebná místa pro CTC na plazmatické membráně spermií. CTC je fluorofor a kapacitace se vyhodnocuje jako změna fluorescenčního vzoru na povrchu spermie.

Reference

↑ Chang MC, Fertilizing capacity of spermatozoa deposited in Fallopian tubes, Nature 1951; 168:997-998
↑ Austin CR, The ”capacitation“ of the mammalian sperm, Nature 1952; 170:326
↑ Suarez SS, Ho HC, Hyperactivated motility in sperm, Reprod Domest Anim. 2003 Apr;38(2):119-24
↑ Cohen-Dayag A, Tur-Kaspa I, Dor J, Mashiach S, Eisenbach M, Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 21;92(24):11039-43
↑ Lefebvre R, Suarez SS, Effect of capacitation on bull sperm binding to homologous oviductal epithelium, Biol Reprod. 1996 Mar;54(3):575-82
↑ Cross NL, Role of cholesterol in sperm capacitation, Biol Reprod. 1998 Jul;59(1):7-11
↑ Harrison RA, Gadella BM, Bicarbonate-induced membrane processing in sperm capacitation, Theriogenology. 2005 Jan 15;63(2):342-51
↑ Nolan JP, Hammerstedt RH, Regulation of membrane stability and the acrosome reaction in mammalian sperm, FASEB J. 1997 Jul;11(8):670-82
↑ Adeoya-Osiguwa SA, Fraser LR, A biphasic pattern of 45Ca2+ uptake by mouse spermatozoa in vitro correlates with changing functional potential, J Reprod Fertil. 1993 Sep;99(1):187-94
↑ Rojas FJ, Patrizio P, Do J, Silber S, Asch RH, Moretti-Rojas I, Evidence for a novel adenylyl cyclase in human epididymal sperm, Endocrinology. 1993 Dec;133(6):3030-3
↑ Seshagiri PB, Mariappa D, Aladakatti RH, Tyrosine phosphorylated proteins in mammalian spermatozoa: molecular and functional aspects, Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;63:313-25
↑ Breitbart H, Cohen G, Rubinstein S. Role of actin cytoskeleton in mammalian sperm capacitation and the acrosome reaction. Reproduction. 2005 Mar;129(3):263-8
↑ Eisenbach M, Mammalian sperm chemotaxis and its association with capacitation, Dev Genet. 1999;25(2):87-94
↑ Bahat A, Eisenbach M, Sperm thermotaxis, Mol Cell Endocrinol. 2006 Jun 27;252(1-2):115-9. Epub 2006 May 2
↑ Töpfer-Petersen E, Petrounkina AM, Ekhlasi-Hundrieser M, Oocyte-sperm interactions, Anim Reprod Sci. 2000 Jul 2;60-61:653-62
↑ Kaji K, Kudo A, The mechanism of sperm-oocyte fusion in mammals, Reproduction. 2004 Apr;127(4):423-9

[1] Chang MC, Fertilizing capacity of spermatozoa deposited in Fallopian tubes, Nature 1951; 168:997-998

[2] Austin CR, The ”capacitation“ of the mammalian sperm, Nature 1952; 170:326

[3] Suarez SS, Ho HC, Hyperactivated motility in sperm, Reprod Domest Anim. 2003 Apr;38(2):119-24

[4] Cohen-Dayag A, Tur-Kaspa I, Dor J, Mashiach S, Eisenbach M, Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors, Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Nov 21;92(24):11039-43

[5] Lefebvre R, Suarez SS, Effect of capacitation on bull sperm binding to homologous oviductal epithelium, Biol Reprod. 1996 Mar;54(3):575-82

[6] Cross NL, Role of cholesterol in sperm capacitation, Biol Reprod. 1998 Jul;59(1):7-11

[7] Harrison RA, Gadella BM, Bicarbonate-induced membrane processing in sperm capacitation, Theriogenology. 2005 Jan 15;63(2):342-51

[8] Nolan JP, Hammerstedt RH, Regulation of membrane stability and the acrosome reaction in mammalian sperm, FASEB J. 1997 Jul;11(8):670-82

[9] Adeoya-Osiguwa SA, Fraser LR, A biphasic pattern of 45Ca2+ uptake by mouse spermatozoa in vitro correlates with changing functional potential, J Reprod Fertil. 1993 Sep;99(1):187-94

[10] Rojas FJ, Patrizio P, Do J, Silber S, Asch RH, Moretti-Rojas I, Evidence for a novel adenylyl cyclase in human epididymal sperm, Endocrinology. 1993 Dec;133(6):3030-3

[11] Seshagiri PB, Mariappa D, Aladakatti RH, Tyrosine phosphorylated proteins in mammalian spermatozoa: molecular and functional aspects, Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;63:313-25

[12] Breitbart H, Cohen G, Rubinstein S. Role of actin cytoskeleton in mammalian sperm capacitation and the acrosome reaction. Reproduction. 2005 Mar;129(3):263-8

[13] Eisenbach M, Mammalian sperm chemotaxis and its association with capacitation, Dev Genet. 1999;25(2):87-94

[14] Bahat A, Eisenbach M, Sperm thermotaxis, Mol Cell Endocrinol. 2006 Jun 27;252(1-2):115-9. Epub 2006 May 2

[15] Töpfer-Petersen E, Petrounkina AM, Ekhlasi-Hundrieser M, Oocyte-sperm interactions, Anim Reprod Sci. 2000 Jul 2;60-61:653-62

[16] Kaji K, Kudo A, The mechanism of sperm-oocyte fusion in mammals, Reproduction. 2004 Apr;127(4):423-9

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]