LAMP

Η ισοθερμική ενίσχυση μέσω βρόχου (LAMP) είναι μια τεχνική ενός σωλήνα για την ενίσχυση του DNA και μια εναλλακτική λύση χαμηλού κόστους για την ανίχνευση ορισμένων ασθενειών. Η ισοθερμική ενίσχυση με τη βοήθεια βρόχου αντίστροφης μεταγραφής (RT-LAMP) συνδυάζει την LAMP με ένα στάδιο αντίστροφης μεταγραφής για να επιτρέψει την ανίχνευση RNA.

Η LAMP είναι μια ισοθερμική τεχνική ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων. Σε αντίθεση με την τεχνολογία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), στην οποία η αντίδραση πραγματοποιείται με μια σειρά εναλλασσόμενων βημάτων θερμοκρασίας ή κύκλων, η ισοθερμική ενίσχυση πραγματοποιείται σε σταθερή θερμοκρασία και δεν απαιτεί θερμικό κυκλοποιητή.

Τεχνική

Στην LAMP, η αλληλουχία-στόχος ενισχύεται σε σταθερή θερμοκρασία 60-65 °C (140-149 °F) χρησιμοποιώντας είτε δύο είτε τρία σετ εκκινητών και μια πολυμεράση με υψηλή δραστικότητα μετατόπισης κλώνων εκτός από δραστικότητα αντιγραφής. Συνήθως, χρησιμοποιούνται 4 διαφορετικοί εκκινητές για την ενίσχυση 6 διαφορετικών περιοχών του γονιδίου-στόχου, γεγονός που αυξάνει την ειδικότητα. Ένα πρόσθετο ζεύγος "εκκινητών βρόχου" μπορεί να επιταχύνει περαιτέρω την αντίδραση. Η ποσότητα DNA που παράγεται στην LAMP είναι σημαντικά υψηλότερη από την ενίσχυση με βάση την PCR.

Σχήμα μιας LAMP βιοδεικτών νουκλεϊκών οξέων από ακατέργαστα δείγματα ανεπεξέργαστων λυμάτων, για την ταχεία ποσοτικοποίηση του ειδικού για τον άνθρωπο μιτοχονδριακού DNA (mtDNA).

Το προϊόν ενίσχυσης μπορεί να ανιχνευθεί μέσω φωτομετρίας, μετρώντας τη θολερότητα που προκαλείται από το ίζημα πυροφωσφορικού μαγνησίου στο διάλυμα ως παραπροϊόν της ενίσχυσης. Αυτό επιτρέπει την εύκολη απεικόνιση με γυμνό μάτι ή μέσω απλών προσεγγίσεων φωτομετρικής ανίχνευσης για μικρούς όγκους. Η αντίδραση μπορεί να παρακολουθείται σε πραγματικό χρόνο είτε με τη μέτρηση της θολερότητας είτε με φθορισμό με τη χρήση χρωστικών παρεμβολής, όπως το SYTO 9. Οι χρωστικές, όπως το πράσινο SYBR, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη δημιουργία μιας ορατής αλλαγής χρώματος που μπορεί να γίνει αντιληπτή με γυμνό μάτι χωρίς την ανάγκη ακριβού εξοπλισμού ή για μια αντίδραση που μπορεί να μετρηθεί με μεγαλύτερη ακρίβεια με όργανα. Τα μόρια χρωστικής παρεμβάλλουν ή επισημαίνουν απευθείας το DNA και με τη σειρά τους μπορούν να συσχετιστούν με τον αριθμό των αντιγράφων που υπάρχουν αρχικά. Ως εκ τούτου, η LAMP μπορεί επίσης να είναι ποσοτική.

Η ανίχνευση της ενίσχυσης του DNA LAMP εντός του σωλήνα είναι δυνατή με τη χρήση καλσεΐνης φορτωμένης με μαγγάνιο, η οποία αρχίζει να φθορίζει κατά τη συμπλοκοποίηση του μαγγανίου με πυροφωσφορικό κατά τη σύνθεση του DNA in vitro.

Μια άλλη µέθοδος οπτικής ανίχνευσης των αµπλικονίων LAMP µε το µάτι βασίστηκε στην ικανότητά τους να υβριδοποιούνται µε συµπληρωµατικό ss-DNA συνδεδεµένο µε χρυσό και έτσι να αποτρέπουν την κανονική αλλαγή χρώµατος από κόκκινο σε µωβ-µπλε που θα συνέβαινε διαφορετικά κατά τη συσσωµάτωση των σωµατιδίων χρυσού που προκαλείται από άλατα. Έτσι, η μέθοδος LAMP σε συνδυασμό με την ανίχνευση αμπλικονίων με AuNP μπορεί να έχει πλεονεκτήματα έναντι άλλων μεθόδων όσον αφορά τη μείωση του χρόνου ανάλυσης, την επιβεβαίωση των αμπλικονίων με υβριδισμό και τη χρήση απλούστερου εξοπλισμού (δηλαδή, δεν χρειάζεται θερμοκυκλοποιητής, εξοπλισμός ηλεκτροφόρησης ή υπεριώδης διαφωτιστής).

Χρήσεις και οφέλη

Η LAMP είναι μια σχετικά νέα τεχνική ενίσχυσης του DNA, η οποία λόγω της απλότητας, της ανθεκτικότητας και του χαμηλού κόστους της θα μπορούσε να προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα. Η LAMP έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως απλή δοκιμασία διαλογής στο πεδίο ή στο σημείο περίθαλψης από τους κλινικούς ιατρούς. Επειδή η LAMP είναι ισοθερμική, γεγονός που εξαλείφει την ανάγκη για ακριβούς θερμοκυκλωτές που χρησιμοποιούνται στη συμβατική PCR, μπορεί να αποτελέσει μια ιδιαίτερα χρήσιμη μέθοδο για τη διάγνωση λοιμωδών νοσημάτων σε χώρες με χαμηλό και μεσαίο εισόδημα. Η LAMP μελετάται ευρέως για την ανίχνευση μολυσματικών ασθενειών όπως η φιλαρίαση, ο ιός Zika, η φυματίωση, η ελονοσία, η ασθένεια του ύπνου και ο SARS-CoV-2. Στις αναπτυσσόμενες περιοχές, δεν έχει ακόμη επικυρωθεί εκτενώς για άλλα κοινά παθογόνα.

Έχει παρατηρηθεί ότι η LAMP είναι λιγότερο ευαίσθητη (πιο ανθεκτική) από την PCR σε αναστολείς σε πολύπλοκα δείγματα όπως το αίμα, πιθανώς λόγω της χρήσης διαφορετικής DNA πολυμεράσης (συνήθως Bst - Bacillus stearothermophilus - DNA πολυμεράση και όχι Taq πολυμεράση όπως στην PCR). Αρκετές αναφορές περιγράφουν την επιτυχή ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών από ελάχιστα επεξεργασμένα δείγματα, όπως το θερμικά επεξεργασμένο αίμα, ή παρουσία μητρών κλινικών δειγμάτων. Αυτό το χαρακτηριστικό της LAMP μπορεί να είναι χρήσιμο σε περιβάλλοντα χαμηλών πόρων ή πεδίου όπου η συμβατική εκχύλιση DNA ή RNA πριν από τη διαγνωστική εξέταση μπορεί να είναι ανέφικτη.

Περιορισμοί

Η LAMP είναι λιγότερο ευέλικτη από την PCR, την πιο καθιερωμένη τεχνική ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων. Η LAMP είναι χρήσιμη κυρίως ως τεχνική διάγνωσης ή ανίχνευσης, αλλά δεν είναι χρήσιμη για κλωνοποίηση ή πολλές άλλες εφαρμογές μοριακής βιολογίας που επιτρέπει η PCR. Επειδή η LAMP χρησιμοποιεί 4 (ή 6) εκκινητές που στοχεύουν 6 (ή 8) περιοχές σε ένα αρκετά μικρό τμήμα του γονιδιώματος και επειδή ο σχεδιασμός των εκκινητών υπόκειται σε πολυάριθμους περιορισμούς, είναι δύσκολο να σχεδιαστούν σύνολα εκκινητών για την LAMP "με το μάτι". Γενικά χρησιμοποιούνται δωρεάν, ανοικτού κώδικα ή εμπορικά πακέτα λογισμικού για να βοηθήσουν στο σχεδιασμό εκκινητών LAMP, αν και οι περιορισμοί σχεδιασμού εκκινητών σημαίνουν ότι υπάρχει λιγότερη ελευθερία επιλογής της περιοχής στόχου από ό,τι με την PCR.

Σε μια διαγνωστική εφαρμογή, αυτό πρέπει να εξισορροπηθεί με την ανάγκη επιλογής ενός κατάλληλου στόχου (π.χ. μια συντηρημένη περιοχή σε ένα εξαιρετικά μεταβλητό ιικό γονιδίωμα ή ένας στόχος που είναι ειδικός για ένα συγκεκριμένο στέλεχος παθογόνου). Ενδέχεται να απαιτούνται πολλαπλές εκφυλισμένες αλληλουχίες για την κάλυψη των διαφόρων παραλλαγών στελεχών του ίδιου είδους. Συνέπεια της ύπαρξης ενός τέτοιου κοκτέιλ εκκινητών μπορεί να είναι η μη ειδική ενίσχυση στην όψιμη ενίσχυση.

Οι προσεγγίσεις πολυπλεξίας για την LAMP είναι λιγότερο ανεπτυγμένες από ό,τι για την PCR. Ο μεγαλύτερος αριθμός εκκινητών ανά στόχο στην LAMP αυξάνει την πιθανότητα αλληλεπιδράσεων μεταξύ εκκινητών και εκκινητών για πολυπλεγμένα σύνολα στόχων. Το προϊόν της LAMP είναι μια σειρά από συναθροιστές της περιοχής-στόχου, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μια χαρακτηριστική "σκάλα" ή ένα μοτίβο ζωνών σε πηκτή, αντί για μια μεμονωμένη ζώνη όπως με την PCR. Αν και αυτό δεν αποτελεί πρόβλημα κατά την ανίχνευση μεμονωμένων στόχων με LAMP, οι "παραδοσιακές" (τελικές) εφαρμογές πολλαπλής PCR, όπου η ταυτότητα ενός στόχου επιβεβαιώνεται από το μέγεθος μιας ζώνης σε πηκτή, δεν είναι εφικτές με LAMP. Η πολυπλεξία στην LAMP έχει επιτευχθεί με την επιλογή μιας περιοχής-στόχου με μια περιοχή περιορισμού και την πέψη πριν από την εκτέλεση σε πηκτή, έτσι ώστε κάθε προϊόν να δίνει ένα διαφορετικό μέγεθος θραύσματος, αν και αυτή η προσέγγιση προσθέτει πολυπλοκότητα στον πειραματικό σχεδιασμό και το πρωτόκολλο.

Η χρήση μιας πολυμεράσης DNA που αντικαθιστά την αλυσίδα στην LAMP αποκλείει επίσης τη χρήση ανιχνευτών υδρόλυσης, π.χ. ανιχνευτών TaqMan, οι οποίοι βασίζονται στη δραστηριότητα της 5'-3' εξωνουκλεάσης της Taq πολυμεράσης. Έχει αναφερθεί μια εναλλακτική προσέγγιση πολυπλεξίας σε πραγματικό χρόνο που βασίζεται σε σβέστες φθορισμού.

Η χρωστική SYBR green μπορεί να προστεθεί για την προβολή της LAMP σε πραγματικό χρόνο. Ωστόσο, κατά την όψιμη ενίσχυση, η ενίσχυση των εκκινητών-διμερών μπορεί να συμβάλει σε ψευδώς θετικό σήμα. Η χρήση ανόργανης πυροφωσφατάσης σε μείγμα αντίδρασης SYBR επιτρέπει τη χρήση ανάλυσης τήγματος για τη διάκριση της σωστής ενίσχυσης

Αν και έχουν προταθεί διάφορες στρατηγικές μετριασμού των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων σε δοκιμασίες που βασίζονται σε αυτή τη μέθοδο, η μη ειδική ενίσχυση λόγω διαφόρων παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της απουσίας μηχανισμών πύλης θερμοκρασίας, αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους περιορισμούς της ισοθερμικής ενίσχυσης με τη βοήθεια βρόχου.