Loop-mediated Isothermal Amplification

Loop-mediated Isothermal Amplification eli silmukkavälitteinen isoterminen monistustekniikka (LAMP) on yhden putken tekniikka DNA:n monistamiseen ja edullinen vaihtoehto tiettyjen sairauksien havaitsemiseen. Käänteistranskriptiosilmukkavälitteinen isoterminen amplifikaatio (RT-LAMP) yhdistää LAMP-menetelmän käänteistranskriptiovaiheeseen RNA:n osoittamiseksi.

LAMP on isoterminen nukleiinihappojen monistustekniikka. Toisin kuin polymeraasiketjureaktiotekniikassa (PCR), jossa reaktio suoritetaan vuorottelevien lämpötilavaiheiden tai syklien avulla, isoterminen monistus suoritetaan vakiolämpötilassa, eikä siihen tarvita lämpösykleriä.

Tekniikka

LAMP-menetelmässä kohdesekvenssi monistetaan 60-65 °C:n (140-149 °F) vakiolämpötilassa käyttäen joko kahta tai kolmea alukesarjaa ja polymeraasia, jolla on korkea säikeen siirtymisaktiivisuus replikaatioaktiivisuuden lisäksi. Tyypillisesti käytetään neljää eri aluketta, joilla monistetaan kuusi eri aluetta kohdegeenissä, mikä lisää spesifisyyttä. Ylimääräinen pari "silmukka-alukkeita" voi nopeuttaa reaktiota entisestään. LAMP-menetelmässä tuotetun DNA:n määrä on huomattavasti suurempi kuin PCR-pohjaisessa monistuksessa.

Kaavio käsittelemättömistä jätevesinäytteistä otettujen nukleiinihappobiomarkkereiden LAMP-menetelmästä, jolla voidaan nopeasti kvantifioida ihmiseen spesifisesti liittyvää mitokondriaalista DNA:ta (mtDNA).

Monistustuote voidaan havaita fotometrialla, jossa mitataan sameutta, joka aiheutuu liuoksessa olevasta magnesiumpyrofosfaattisakasta, joka on monistamisen sivutuote. Tämä mahdollistaa helpon visualisoinnin paljain silmin tai yksinkertaisten fotometristen detektiomenetelmien avulla pienissä tilavuuksissa. Reaktiota voidaan seurata reaaliajassa joko mittaamalla sameutta tai fluoresenssilla käyttämällä interkaloivia väriaineita, kuten SYTO 9:ää. Väriaineita, kuten SYBR-vihreää, voidaan käyttää näkyvän värimuutoksen aikaansaamiseksi, joka voidaan havaita paljain silmin ilman kalliita laitteita, tai reaktion aikaansaamiseksi, joka voidaan mitata tarkemmin mittalaitteilla. Väriainemolekyylit interkaloivat tai merkitsevät suoraan DNA:ta, ja ne voidaan puolestaan suhteuttaa alun perin läsnä olevien kopioiden määrään. Näin ollen LAMP voi olla myös kvantitatiivinen.

LAMP-DNA:n monistumisen havaitseminen putkessa on mahdollista käyttämällä mangaanilla ladattua kalseiinia, joka alkaa fluoresoida, kun mangaani kompleksoituu pyrofosfaatin kanssa in vitro DNA-synteesin aikana.

Toinen menetelmä LAMP-amplikonien visuaaliseksi havaitsemiseksi paljain silmin perustui niiden kykyyn hybridisoitua komplementaarisen kultaan sitoutuneen ss-DNA:n kanssa ja siten estää tavanomaisen punaisen värin muuttumisen violetin siniseksi, joka muutoin tapahtuisi kultahiukkasten suolan aiheuttaman aggregaation aikana. LAMP-menetelmällä yhdistettynä amplikonien osoittamiseen AuNP:n avulla voi siis olla etuja muihin menetelmiin verrattuna, sillä määritysaika lyhenee, amplikonit voidaan vahvistaa hybridisaation avulla ja laitteisto on yksinkertaisempi (eli termosykleriä, elektroforeesilaitteistoa tai UV-transvalaisinta ei tarvita).

Käyttö ja hyödyt

LAMP on suhteellisen uusi DNA:n monistustekniikka, joka yksinkertaisuutensa, kestävyytensä ja alhaisen hintansa vuoksi voi tarjota merkittäviä etuja. LAMP-menetelmää voidaan käyttää yksinkertaisena seulontamäärityksenä kentällä tai hoitopaikassa. Koska LAMP on isoterminen, mikä poistaa perinteisessä PCR:ssä käytettävien kalliiden termosyklereiden tarpeen, se voi olla erityisen hyödyllinen menetelmä tartuntatautien diagnosointiin pieni- ja keskituloisissa maissa. LAMP-menetelmää tutkitaan laajalti infektiotautien, kuten filariaasin, zikaviruksen, tuberkuloosin, malarian, unitaudin ja SARS-CoV-2:n, havaitsemiseksi. Kehitysalueilla sitä ei ole vielä validoitu laajasti muiden yleisten taudinaiheuttajien osalta.

LAMP:n on havaittu olevan vähemmän herkkä (vastustuskykyisempi) kuin PCR:n inhibiittoreille monimutkaisissa näytteissä, kuten veressä, mikä johtuu todennäköisesti erilaisen DNA-polymeraasin käytöstä (tyypillisesti Bst - Bacillus stearothermophilus - DNA-polymeraasi eikä Taq-polymeraasi kuten PCR:ssä). Useissa raporteissa kerrotaan, että taudinaiheuttajat on onnistuttu osoittamaan minimaalisesti käsitellyistä näytteistä, kuten lämpökäsitellystä verestä, tai kliinisten näytematriisien läsnä ollessa. Tämä LAMP-menetelmän ominaisuus voi olla hyödyllinen niukkaresurssisissa tai kenttäolosuhteissa, joissa perinteinen DNA:n tai RNA:n uuttaminen ennen diagnostista testausta voi olla epäkäytännöllistä.

Rajoitukset

LAMP ei ole yhtä monipuolinen kuin PCR, joka on vakiintunein nukleiinihappojen monistustekniikka. LAMP on hyödyllinen ensisijaisesti diagnoosi- tai havaitsemistekniikkana, mutta se ei sovellu kloonaukseen tai moniin muihin molekyylibiologisiin sovelluksiin, jotka PCR mahdollistaa. Koska LAMP käyttää neljää (tai kuutta) aluketta, jotka kohdistuvat kuuteen (tai kahdeksaan) alueeseen genomin melko pienessä segmentissä, ja koska alukkeiden suunnitteluun liittyy lukuisia rajoituksia, on vaikeaa suunnitella alukesarjoja LAMP:ia varten "silmämääräisesti". LAMP-alkuaineiden suunnittelussa käytetään yleensä apuna ilmaisia, avoimen lähdekoodin tai kaupallisia ohjelmistopaketteja, vaikka alkuaineiden suunnittelua koskevat rajoitukset tarkoittavat, että kohdekohdan valinnassa ei ole yhtä paljon vapautta kuin PCR:ssä.

Diagnostiikkasovelluksessa tätä on tasapainotettava tarpeeseen valita sopiva kohde (esim. konservoitunut kohta erittäin vaihtelevassa virusgenomissa tai kohde, joka on spesifinen tietylle patogeenikannalle). Saman lajin eri varianttikantojen kattamiseksi saatetaan tarvita useita degeneroituja sekvenssejä. Seurauksena tällaisesta alukkeiden cocktailista voi olla epäspesifinen monistuminen myöhäisessä monistuksessa.

LAMP:n moninkertaistamismenetelmät eivät ole yhtä kehittyneitä kuin PCR:n. Koska LAMP:ssä on enemmän alukkeita kohdetta kohti, alukkeen ja alukkeen vuorovaikutusten todennäköisyys kasvaa multipleksoitujen kohdesarjojen osalta. LAMP:n tuote on sarja kohdealueen konkatomeereja, jotka muodostavat geelille tyypillisen "tikapuut" tai kaistakuvion, eikä yhtä ainoaa kaistaa kuten PCR:ssä. Vaikka tämä ei ole ongelma, kun LAMP:llä havaitaan yksittäisiä kohteita, "perinteiset" (päätepisteen) multipleksi-PCR-sovellukset, joissa kohteen identiteetti vahvistetaan geelillä olevan kaistan koon perusteella, eivät ole toteutettavissa LAMP:n avulla. LAMP:n multipleksointi on saavutettu valitsemalla kohdealue, jossa on restriktiokohta, ja digestoimalla se ennen geelillä ajoa siten, että jokainen tuote tuottaa erikokoisen fragmentin, mutta tämä lähestymistapa lisää monimutkaisuutta koesuunnitelmaan ja protokollaan.

Säikeen siirtävän DNA-polymeraasin käyttö LAMP:ssa estää myös hydrolyysikoettimien, esim. TaqMan-koettimien, käytön, jotka perustuvat Taq-polymeraasin 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuuteen. Vaihtoehtoinen reaaliaikainen multipleksointimenetelmä, joka perustuu fluoresenssisammuttimiin, on raportoitu.

SYBR-vihreää väriainetta voidaan lisätä LAMP:n reaaliaikaiseen tarkasteluun. Myöhäisessä amplifikaatiossa alukkeen ja dimeerin monistuminen voi kuitenkin aiheuttaa väärän positiivisen signaalin. Epäorgaanisen pyrofosfataasin käyttö SYBR-reaktioseoksessa mahdollistaa sulatusanalyysin käyttämisen oikean amplifikaation erottamiseksi.

Vaikka tähän menetelmään perustuvissa määrityksissä on ehdotettu erilaisia strategioita väärien positiivisten tulosten lieventämiseksi, eri tekijöistä, kuten lämpötilaporttimekanismien puuttumisesta, johtuva epäspesifinen monistuminen on yksi silmukkavälitteisen isotermisen monistamisen suurimmista rajoituksista.

Aiheesta muualla

• Anni Ikonen ja Maijastiina Kontio: Illumigenestä GenomEraan: Clostridium difficile – analyysimenetelmien vertailu. (suomenkielisen termin lähde) Oulun AMK, 2016. Teoksen verkkoversio (viitattu 7.12.2021).