תספיג DNA
תספיג DNA (באנגלית: Southern Blot) היא שיטה בביולוגיה מולקולרית לקביעת גודלו ונוכחותו של רצף DNA ייחודי.
השיטה פותחה ב-1975 על ידי הביולוג הבריטי אדווין סאת'רן (Edwin Southern), והיא נקראת על שמו. פירוש שם המשפחה של הממציא הוא "דרומי"; שיטות נוספות, המבוססות על סאת'רן בלוט ואשר פותחו מאוחר יותר, זכו לשמות רשמיים חצי-היתוליים, אשר מהווים משחק מילים על השם המקורי: תספיג RNA מכונה "Northern blot" (תספיג "צפוני") ותספיג חלבון נקרא "Western blot" (תספיג "מערבי"). במעבדות בישראל מרבים להשתמש במונחים הלועזיים המקוריים ולא במונחים העבריים התקניים.
השיטה
עריכהלאורך גדיל ה-DNA מצויים רצפים קצרים (בגודל 15-4 נוקלאוטידים) המכונים אתרי הגבלה, ולכל אחד מהם אנזים הגבלה ייחודי, המזהה אותו ומבצע על-ידו חיתוך של הגדיל. תוחלת מספר אתרי ההגבלה בגדיל נתון המתאימים לאנזים הגבלה מסוים, גדל ביחס ישר לפי מספר הנוקלאוטידים בגדיל, וביחס הפוך-מעריכי למספרם באתר ההגבלה. את המקטעים המתקבלים מהחיתוך ניתן להפריד ולאפיין על-פי גודלם, על ידי הרצתם באלקטרופורזה בג'ל (בדרך-כלל של אגרוז). הג'ל מכיל מעברים מיקרוסקופיים, המאפשרים מעבר מוגבל של מולקולות דרכם, כאשר גודל המולקולה משפיע על יכולתה לעבור דרכו ועל מהירות המעבר (מולקולה קטנה תעבור מהר יותר). ניתן להכין ג'לים בריכוזים שונים עבור מקטעים בגדלים שונים. כדי לאפשר את התנועה, מופעל שדה חשמלי ומולקולות ה-DNA הטעונות שלילית נודדות מהקוטב השלילי אל החיובי.
לאחר סיום ההפרדה החשמלית מניחים את הג'ל על גבי ממברנת ניטרוצלולוזה או ממברנת ניילון ובעזרת לחץ או דיפוזיה של נוזלים מעבירים את הדנ"א לממברנה. ה-DNA מקובע לניטרוצלולוזה על ידי חימום או לניילון על ידי קרינת UV.
את המקטעים בעלי הרצף המבוקש ניתן לאתר בעזרת מולקולת "גלאי"- מולקולת דנ"א בעלת רצף משלים לרצף הנבדק. הגלאי מסומן באופן רדיואקטיבי או פלואורסצנטי. ממברנת ה-DNA, הגלאי ובופר ההיברידיזציה מוכנסים לתא חימום כדי לגרום לדנטורציה (פירוק) של ה-DNA, וכך להפוך אותו מדו-גדילי לחד-גדילי. הגלאי מזהה את הרצף המשלים לו ומתאחד עמו. בהמשך, הממברנה נחשפת לסרט צילום; במקום שבו נמצא הגן המבוקש נוצרים פסים (בנדים) על גבי סרט הצילום. ניתן לדעת את אורכה של מולקולת ה-DNA בהתאם למיקומה היחסי בג'ל (המולקולה רצה בהתאם לאורכה).
לרוב משתמשים בבסיס לצורך הפרדת ה-DNA הדו-גדילי, ולא בחימום כנהוג בשיטת ה-PCR (המגבירה מקטע DNA מסוים). הבסיס מנתק את קשרי המימן המשולשים והכפולים בין הגדילים ומאפשרים הצמדות גלאי רדיואקטיבי\פלואורסצנטי המשלים לאותו גדיל שאנו רוצים לבדוק את נוכחותו.
ראו גם
עריכהקישורים חיצוניים
עריכה
- Southern blot, מצגת Shockwave