Pyrosequencing

פירוסיקוונסינג (Pyrosequencing) היא שיטה לריצוף DNA המבוססת על זיהוי פירופוספטים שמשתחררים בעת פולימרציית DNA, ומכאן שמה. הפירופוספטים שמשתחררים מזוהים באמצעות תגובת שרשרת שהם מחוללים, שגורמת לפליטת אור. זוהי שיטה בה הריצוף מתבצע על ידי סינתזה, שבמהלכה נבנה גדיל משלים על גבי רצף גדיל המקור.

תרשים המדגים איך פירוסיקוונסינג עובד

השיטה פותחה על ידי מוסטפא רונגי ופל ניירן במכון המלכותי לטכנולוגיה בסטוקהולם בשנת 1996.

באמצעות השיטה ניתן לקבוע מהו רצף ה־DNA של גדיל המקור באמצעות אור שמשתחרר כאשר הנוקלאוטיד המשלים הבא מתווסף לגדיל המשלים ההולך ונבנה על גבי גדיל המקור. הקביעה מתאפשרת תודות לעובדה שבכל פעם מוסיפים לתמיסה רק אחד מארבעת הנוקלאוטידים – A,‏ C,‏ G ו-T, ולכן בכל פעם רק אחת מארבע ה"אותיות" הללו יכולה להתווסף לגדיל המשלים ההולך ונבנה. עוצמת האור מלמדת אם האות התווספה לגדיל פעם אחת או מספר פעמים (מופעים רצופים של אותו נוקלאוטיד). לפני שמוסיפים לתמיסה את הנוקלאוטיד הבא, מפרקים את המולקולות של הנוקלאוטיד הקודם שלא התווספו לגדיל, כדי שבכל פעם יתווספו לגדיל רק מולקולות של נוקלאוטיד מסוג אחד. תהליך זה מתבצע שוב ושוב עם כל אחת מארבע האותיות עד שנקבע רצף ה־DNA של גדיל המקור.

פרוצדורה

במהלך "ריצוף על ידי סינתזה" נוטלים גדיל בודד של ה־DNA שמעוניינים לרצף ומרכיבים את הגדיל המשלים שלו על ידי אנזימים. שיטת ה-pyrosequencing מבוססת על זיהוי הפעילות של DNA פולימראז (אנזים המסנתז DNA), באמצעות אנזים כימולומינסטי (אנזים המקיים תגובה בה נוצר אור בלי חום). בעיקרו של דבר, השיטה מאפשרת לרצף גדיל בודד של DNA על ידי הרכבת הגדיל המשלים שלו לאורכו, זוג בסיסים אחד בכל פעם, וזיהוי הבסיס שנוסף בפועל בכל צעד. גדיל ה־DNA המשמש כתבנית נשאר במקומו, ותמיסות של הנוקלאוטידים A,‏ C,‏ T ו-G מוספות ומוסרות מהתגובה עמו בזו אחר זו. אור נוצר רק כאשר תמיסת הנוקלאוטיד משלימה את הבסיס הפנוי הבא על גבי הגדיל המשמש כתבנית. סדרת התמיסות שיוצרות אות כימולומינסטי מאפשרת לקבוע את הרצף של הגדיל המשמש כתבנית.

גדיל ה־DNA הבודד המשמש כתבנית מוכלא לתוך פריימר ריצוף ומודגר עם האנזימים DNA פולימראז, ATP סולפורילאז, לוציפראז ואפיראז ועם הסובסטרטים אדנוזין 5' פוספוסולפט (APS) ולוציפרין.

1. הוספה של אחד מארבעת הטריפוספטים הדיאוקסינוקלאוטידים (dNTPs) (במקום להוסיף dATP מוסיפים dAPTaS, שאינו סובסטרט של לוציפראז, כדי להימנע מרעש) מאתחלת את השלב השני. DNA פולימראז מרכיב את ה-dNTP הנכון, המשלים, על גבי הגדיל המשמש כתבנית. הרכבה זו מובילה לשחרור פירופוספט (PPi).
2. ATP סולפורילאז ממיר את הפירופוספט ל-ATP (אדנוזין טרי-פוספט) בנוכחות האדנוזין 5' פוספוסולפט. ATP זה מתפקד כסובסטרט עבור ההמרה מתווכת הלוציפראז של לוציפרין לאוקסילוציפרין, המייצרת אור נראה בכמויות פרופורציונליות לכמות ה-ATP. האור הנוצר בתגובה שמאיץ הלוציפראז נקלט על ידי מצלמה ומנותח על ידי פירוגרם.
3. נוקלאוטידים שלא הורכבו על גבי הגדיל המשמש כתבנית וכן ה-ATP מפורקים על ידי האנזים אפיראז, והריאקציה יכולה להתחיל מחדש עם נוקלאוטיד אחר.

את התבניות עבור pyrosequencing ניתן לייצר הן באמצעות יצירת תבנית שלב מוצק (סטרפטווידין – חרוזים מגנטיים מצופים) והן באמצעות יצירת תבנית אנזימטית (אפיראז + אקסונוקליאז). דהיינו, ניתן לחלק את ה-Pyrosequencing לשני סוגים: Pyrosequencing של השלב המוצק ו-Pyrosequencing של השלב הנוזלי.

מגבלות

לשיטת ה-pyrosequencing יש כרגע מגבלה שאורך הקריאות האינדיבידואליות של רצף ה-DNA הוא בסביבות 300–500 נוקלאוטידים, קצר יותר מהקריאות באורך 800–1,000 נוקלאוטידים שניתן להשיג בשיטות מסוג סיום שרשרת (chain termination) (לדוגמה, שיטת סנגר). הקריאות הקצרות עלולות להקשות על הרכבת הגנום, במיוחד עבור רצפים שכוללים כמות גדולה של DNA חוזרני. בנוסף, העובדה שאין בשיטה פרוצדורה לגילוי שגיאות, מגבילה את מידת הדיוק שלה. נכון לשנת 2007, השיטה משמשת בעיקר לריצוף חוזר או לריצוף גנומים שעבורם כבר קיים רצף של קרוב משפחה קרוב.

מסחור

חברת Pyrosequencing AB שבאופסלה, שוודיה, נוסדה באמצעות מימון שסיפקה קרן ההון סיכון HealthCap, במטרה לפתח ייצור מסחרי של מכונות וריאגנטים עבור ריצוף רצפי DNA קצרים תוך שימוש בטכניקת ה-pyrosequencing.‏ Pyrosequencing AB הייתה רשומה בבורסת סטוקהולם ב-1999. שם החברה הוחלף ל-Biotage ב-2003. קו עסקי ה-pyrosequencing נרכש על ידי קיאגן ב-2008. טכנולוגיית ה-pyrosequencing ניתנה ברישיון לחברה 454 life sciences.‏ 454 פיתחה טכנולוגיית pyrosequencing מבוססת מערך (array) שיצאה כפלטפורמה לריצוף DNA בקנה מידה רחב. הראויים ביותר לציון הם היישומים לריצוף גנום ולמטגנומיקה. GS-FLX, פלטפורמת ה-pyrosequencing האחרונה שייצרה 454 יכולה לייצר 400 מגה-בייט בריצה של 10 שעות באמצעות מכונה אחת. עלות כל ריצה כזאת היא בין 5,000–7,000 דולרים אמריקאים.^{[דרוש מקור]} פלטפורמה זו היא כעת בבעלות החברה Roche Diagnostics.

בשנת 2013 הכריזה חברת הופמן לה-רוש שהיא מפסיקה לייצר את פלטפורמת הריצוף 454.

לקריאה נוספת

• "Definition of pyrosequencing from the Nature Reviews Genetics Glossary". Retrieved 2008-10-28.
• Ronaghi; Uhlén, M; Nyrén, P (1998-07-17). "A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science. 281 (5375): 363. PMID 9705713. doi:10.1126/science.281.5375.363.
• Ronaghi; Karamohamed, S; Pettersson, B; Uhlén, M; Nyrén, P (1996). "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry. 242 (1): 84–9. PMID 8923969. doi:10.1006/abio.1996.0432.
• Nyrén, P. (2007). "The History of Pyrosequencing". Methods Mol Biology. 373: 1–14. PMID 17185753. doi:10.1385/1-59745-377-3:1.
• Qiagen acquires Biotage