Cilpmediēta izotermiska amplifikācija

Šis raksts ir par DNS pavairošanas metodi. Par programmatūru paketi skatīt rakstu LAMP.

Cilpmediēta izotermiska amplifikācija (angļu: Loop-mediated isothermal amplification jeb LAMP) ir vienas mēģenes metode DNS amplifikācijai (daudzuma pavairošanai) un lēta alternatīva noteiktu slimību noteikšanai. Apgrieztās transkripcijas cilpmediēta izotermiska amplifikācija (RT-LAMP) apvieno LAMP ar apgrieztās transkripcijas procesu, lai varētu noteikt RNS.

LAMP ir izotermiska nukleīnskābju amplifikācijas metode. Atšķirībā no polimerāzes ķēdes reakcijas (PĶR) tehnoloģijas, kurā reakciju veic ar virkni temperatūras maiņas soļu vai ciklu, izotermiskā amplifikācija notiek nemainīgā temperatūrā, un tai nav nepieciešams termiskais ciklers.

Tehnika

LAMP gadījumā mērķa sekvenci amplificē nemainīgā 60—65 °C (140—149 °F) temperatūrā, izmantojot divus vai trīs praimeru komplektus un polimerāzi ar augstu virknes pārvietošanas aktivitāti papildus replikācijas aktivitātei. Parasti izmanto 4 dažādus praimerus, lai amplificētu 6 atšķirīgus mērķa gēna reģionus, kas palielina specifiskumu. Papildu "cilpas praimeru" pāris var vēl vairāk paātrināt reakciju. LAMP procesā iegūtais DNS daudzums ir ievērojami lielāks nekā uz PCR balstītā amplifikācijā.

Nukleīnskābju biomarķieru LAMP no neapstrādātiem, neapstrādātiem notekūdeņu paraugiem, lai ātri kvantitatīvi noteiktu cilvēkam specifisku mitohondriālo DNS (mtDNS).

Amplifikācijas produktu var noteikt, izmantojot fotometriju, mērot duļķainību, ko rada magnija pirofosfāta nogulsnes šķīdumā kā amplifikācijas blakusprodukts. Tas ļauj viegli vizualizēt rezultātu ar neapbruņotu aci vai izmantojot vienkāršas fotometriskas noteikšanas metodes maziem apjomiem. Reakcijai var sekot reāllaikā, mērot duļķainību vai fluorescenci, izmantojot interkalizējošas krāsvielas, piemēram, SYTO 9. Krāsvielas, piemēram, SYBR zaļo, var izmantot, lai radītu redzamas krāsas izmaiņas, ko var redzēt ar neapbruņotu aci bez dārga aprīkojuma, vai lai reakciju varētu precīzāk izmērīt ar instrumentiem. Krāsvielu molekulas interkalējas vai tieši marķē DNS, un tās savukārt var saistīt ar sākotnēji esošo kopiju skaitu. Tādējādi LAMP var būt arī kvantitatīva.

LAMP DNS amplifikācijas noteikšana mēģenē ir iespējama, izmantojot kalceīnu ar mangānu, kas sāk fluorescēt pēc tam, kad in vitro DNS sintēzes laikā mangāns kompleksējas ar pirofosfātu.

Cita metode LAMP amplikonu vizuālai noteikšanai ar neapbruņotu aci tika balstīta uz to spēju hibridizēties ar komplementāro zelta saistīto ss-DNS un tādējādi novērst parasto sarkanās krāsas maiņu uz violeti zilu, kas citādi notiktu sāls izraisītas zelta daļiņu agregācijas laikā. Tādējādi LAMP metodei apvienojumā ar amplikonu noteikšanu ar AuNP var būt priekšrocības salīdzinājumā ar citām metodēm, jo saīsinās testēšanas laiks, amplikonu apstiprināšana ar hibridizāciju un vienkāršāka aprīkojuma izmantošana (t. i., nav nepieciešams termociklers, elektroforēzes iekārta vai UV transiluminators).

Lietošana un priekšrocības

LAMP ir salīdzinoši jauna DNS amplifikācijas metode, kas tās vienkāršības, izturības un zemo izmaksu dēļ varētu sniegt lielas priekšrocības. LAMP var izmantot kā vienkāršu skrīninga testu uz vietas vai klīnicistu aprūpes punktā. Tā kā LAMP ir izotermiska, kas novērš vajadzību pēc dārgiem termocikleriem, ko izmanto parastajā PCR, tā var būt īpaši noderīga metode infekcijas slimību diagnostikai valstīs ar zemiem un vidējiem ienākumiem. LAMP tiek plaši pētīta, lai noteiktu tādas infekcijas slimības kā filariozi, Zikas vīrusu, tuberkulozi, malāriju, miega slimību un SARS-CoV-2. Jaunattīstības reģionos tā vēl ir plaši jāapstiprina attiecībā uz citiem izplatītiem patogēniem.

Ir novērots, ka LAMP ir mazāk jutīga (izturīgāka) nekā PCR pret inhibitoriem sarežģītos paraugos, piemēram, asinīs, iespējams, tāpēc, ka tiek izmantota cita DNS polimerāze (parasti Bst - Bacillus stearothermophilus DNS polimerāze, nevis Taq polimerāze kā PCR). Vairākos ziņojumos aprakstīta sekmīga patogēnu noteikšana no minimāli apstrādātiem paraugiem, piemēram, termiski apstrādātām asinīm, vai klīnisko paraugu matricās. Šī LAMP īpašība var būt noderīga apstākļos, kad ir maz resursu vai lauka apstākļos, kur parastā DNS vai RNS ekstrakcija pirms diagnostikas testēšanas var būt nepraktiska.

Ierobežojumi

LAMP ir mazāk universāla nekā PĶR, kas ir vispāratzītākā nukleīnskābju amplifikācijas metode. LAMP ir noderīga galvenokārt kā diagnostikas vai noteikšanas metode, bet tā nav noderīga klonēšanai vai daudziem citiem molekulārās bioloģijas lietojumiem, ko nodrošina PCR. Tā kā LAMP izmanto 4 (vai 6) praimerus, kas vērsti uz 6 (vai 8) reģioniem diezgan nelielā genoma segmentā, un tā kā praimeru projektēšana ir pakļauta daudziem ierobežojumiem, ir grūti "no galvas" izstrādāt praimeru komplektus LAMP. Lai palīdzētu izstrādāt LAMP praimerus, parasti izmanto bezmaksas, atvērtā koda vai komerciālas programmatūras paketes, lai gan praimeru izstrādes ierobežojumi nozīmē, ka mērķa vietas izvēle ir mazāk brīva nekā PCR gadījumā.

Diagnostikas lietojumā tas ir jāsabalansē ar nepieciešamību izvēlēties piemērotu mērķi (piemēram, konservatīvu vietu ļoti mainīgā vīrusa genomā vai mērķi, kas ir specifisks konkrētam patogēna celmam). Lai aptvertu vienas sugas dažādu paveidu celmus, var būt nepieciešamas vairākas deģenerētas sekvences. Šāda praimeru kokteiļa sekas var būt nespecifiska amplifikācija vēlīnā amplifikācijā.

LAMP multipleksēšanas metodes ir mazāk attīstītas nekā PCR. Lielāks praimeru skaits katram mērķim LAMP palielina praimeru un praimeru mijiedarbības iespējamību attiecībā uz multipleksētiem mērķa komplektiem. LAMP produkts ir virkne mērķa reģiona konkatemeru, kas uz gela veido raksturīgu "kāpnes" vai joslu zīmējumu, nevis vienu joslu kā PCR gadījumā. Lai gan tas nerada problēmas, ar LAMP atklājot atsevišķus mērķus, "tradicionālie" (gala punkta) daudzkārtējas PCR lietojumi, kuros mērķa identitāti apstiprina pēc joslas lieluma gelā, ar LAMP nav iespējami. Multipleksēšana LAMP ir panākta, izvēloties mērķa reģionu ar restriktāzes vietu un sašķeļot to pirms testēšanas uz gela, lai katrs produkts dotu atšķirīga izmēra fragmentu, lai gan šī pieeja sarežģī eksperimenta plānu un protokolu.

DNS polimerāzes, kas izjauc virkni, izmantošana LAMP arī neļauj izmantot hidrolīzes zondes, piemēram, TaqMan zondes, kas ir atkarīgas no Taq polimerāzes 5'-3' eksonukleāzes aktivitātes. Ir ziņots par alternatīvu reāllaika multipleksēšanas pieeju, kuras pamatā ir fluorescences slāpētāji.

SYBR zaļo krāsvielu var pievienot, lai reāllaikā apskatītu LAMP. Tomēr vēlīnās amplifikācijas laikā primer-dimēru amplifikācija var veicināt viltus pozitīvu signālu. Neorganiskās pirofosfatāzes izmantošana SYBR reakcijas maisījumā ļauj izmantot kausēšanas analīzi, lai atšķirtu pareizu amplifikāciju.

Lai gan ir ierosinātas dažādas stratēģijas, kā mazināt viltus pozitīvus rezultātus analīzēs, kas balstītas uz šo metodi, nespecifiska amplifikācija dažādu faktoru dēļ, tostarp temperatūras vārtu mehānismu trūkuma dēļ, ir viens no galvenajiem ar cilpu saistītās izotermiskās amplifikācijas ierobežojumiem.