DNA polymeráza
DNA polymeráza[1] (iné názvy: DNA-polymeráza[2], polymeráza DNA[3], DNK polymeráza[4], DNK-polymeráza, polymeráza DNK) je enzým schopný syntetizovať nové vlákno DNA na základe predlohy vo forme komplementárneho vlákna. Rola DNA polymeráz v bunke spočíva v replikácii DNA. Existuje niekoľko prokaryotických a eukaryotických DNA polymeráz, ktoré sa navzájom odlišujú presnosťou replikácie, schopnosťou opravovať spôsobené chyby a schopnosťou odbúravať vlákno na 5' konci DNA. Ich spoločnou vlastnosťou, ktorá je daná ich funkciou, je schopnosť pripájať monofosfáty deoxyribonukleotidov (dNMP) k 3'-OH koncu syntetizovaného reťazca. Spôsobujú tak polymeráciu jedného vlákna DNA v smere od 5' konca ku 3' koncu, hovorí sa teda, že majú 5'-3' polymerázovú aktivitu.[5]
 3D štruktúra DNA väzobných helix-hairpin-helix motívov v ľudskej DNA polymeráze beta | |
| Identifikátory | |
|---|---|
| Číslo EC | EC 2.7.7.7 |
| Číslo CAS | 9012-90-2 |
| Databázy | |
| IntEnz | hľadať v IntEnz |
| BRENDA | hľadať v BRENDA |
| ExPASy | hľadať v ExPASy |
| KEGG | hľadať v KEGG |
| MetaCyc | hľadať v MetaCyc |
| PDB štruktúry | RSCB PDB PDBe PDBsum |
Dodatočná funkcia väčšiny DNA polymeráz je 3'-5' exonukleázová aktivita, vďaka ktorej sa môže polymeráza "vrátiť" a odbúrať práve syntetizovanú dvojicu nukleotidov. Táto aktivita je dôležitá pre minimalizáciu nepresností pri replikácii DNA. Ďalšou dodatočnou, ale skôr vzácnou funkciou, je 5'-3' exonukleázová aktivita, vďaka ktorej môžu niektoré DNA polymerázy odbúravať primery a DNA opravovať.[5]
Podobne, ako iné enzýmy interagujúce s DNA, potrebuje DNA polymeráza pre svoju aktivitu horečnaté katióny Mg2+, ktoré stabilizujú záporne nabité fosfátové skupiny DNA. Monoméry DNA sa reakcie polymerácie zúčastňujú ako deoxyribonukleotidtrifosfáty a energia pre tvorbu fosfodiesterovej väzby medzi fosfátom a voľnou 3'-OH skupinou syntetizovaného vlákna je dodaná rozštiepením začleňovaného deoxynukleotidtrifosfátu na deoxynukleotidmonofosfát a pyrofosfát.[5]
Prokaryotické DNA polymerázy
upraviťBakteriálne DNA polymerázy sa označujú rímskymi číslicami.
| Polymeráza | Štruktúrny gén | Podjednotky | Molekulová hmotnosť v Daltonoch | 3'-5' exonukleázová aktivita | 5'-3' exonukleázová aktivita | Rýchlosť polymerizácie (nukleotidov/s) | Procesivita (počet pridaných nukleotidov pred disociáciou) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| DNA polymeráza I | polA | 1 | 103 000 | áno | áno | 10-20 | 3-200 |
| DNA polymeráza II | polB | 7 | 88 000 | áno | nie | 40 | 1500 |
| DNA polymeráza III | polC (dnaE) | 10 a viac | 791 500 | áno | nie | 250-1 000 | nad 500 000 |
DNA polymeráza I
upraviťDNA polymeráza I je prvou DNA polymerázou izolovanou z bakteriálneho kmeňa E. coli. Už krátko po jej objave vyšlo najavo, že nie je vhodná pre replikáciu celého genómu E. coli - jej nameraná rýchlosť je 100x pomalšia ako rýchlosť pohybu replikačnej vidličky a má veľmi nízku procesivitu (schopnosť vykonávať činnosť nepretržite). Na rozdiel od ostatných polymeráz však má 5'-3' exonukleázovú aktivitu, vďaka ktorej môže odbúravať nukleotidy (či už DNA alebo RNA vlákna), ktoré by inak bránili polymeráze v pohybe v smere od 5' konca ku 3' koncu syntetizovaného vlákna. Vďaka tejto schopnosti hrá DNA polymeráza I rolu v odbúravaní primerov, rekombinácii a pri oprave DNA. 5'-3' exonukleázovú aktivitu zabezpečuje malý fragment, ktorý je možné od zvyšku enzýmu oddeliť miernou proteolýzou. Zvyšok enzýmu (tzv. veľký alebo Klenowov fragment) si v takom prípade zachováva 5'-3' polymerázovú a 3'-5' exonukleázovú aktivitu.[5]
DNA polymeráza II
upraviťDNA polymeráza II na rozdiel od DNA polymerázy I nemá 5'-3' exonukleázovú aktivitu. Skladá sa až zo siedmich podjednotiek, DNA syntetizuje približne 2x rýchlejšie a má tiež niekoľkonásobne vyššiu procesivitu. Napriek tomu však jej vlastnosti nie sú dostatočné pre replikáciu celého genómu baktérie.[5]
DNA polymeráza III
upraviťDNA polymeráza III je hlavná DNA polymeráza v E. coli. Podobne, ako DNA polymeráze II, jej chýba 5'-3' exonukleázová aktivita, jej rýchlosť je však asi 100x vyššia ako rýchlosť DNA polymerázy I. Za jednu sekundu teda pripojí k jednému vláknu 250-1 000 nukleotidfosfátov. Skladá sa z 13 podjednotiek označovaných gréckymi písmenami - α podjednotka zodpovedá za polymeráciu a ε podjednotka za 3'-5' exonukleázovú aktivitu. Zvyšné jednotky tvoria telo enzýmu, pričom dôležité sú β podjednotky, ktoré fungujú ako zverák a zabezpečujú, aby sa komplex neoddisocioval od vlákna DNA, čiže vysokú procesivitu.[5][6]
Eukaryotické DNA polymerázy
upraviťEukaryotické DNA polymerázy sú štruktúrne a funkčne podobné polymerázam prokaryotickým. Skladajú sa z viacerých podjednotiek a označujú sa gréckymi písmenami.[5]
DNA polymeráza α
upraviťDNA polymeráza α svojou funkciou vybočuje z rady ostatných DNA polymeráz. Nemá 3'-5' exonukleázovú aktivitu a pravdepodobne hrá rolu len v syntéze krátkych primerov, či už z RNA alebo z DNA, tvoriacich Okazakiho fragmenty.[5]
DNA polymeráza β
upraviťDNA polymeráza β hrá rolu predovšetkým pri oprave DNA, konkrétne v miestach, na ktorých boli nukleotidové báze chemicky modifikované (oxidáciou, metyláciou a pod.).[5]
DNA polymeráza γ
upraviťDNA polymeráza γ je živočíšna DNA polymeráza, ktorá slúži exkluzívne na replikáciu DNA v mitochonriách, v ktorých hrá rolu aj v oprave DNA a v jej rekombinácii.[7]
DNA polymeráza δ
upraviťDNA polymeráza δ je hlavnou eukaryotickou polymerázou. Asociuje s proteínom PCNA (z angl. proliferating cell nuclear antigen), ktorý je štruktúrne veľmi podobný β podjednotke bakteriálnej DNA polymerázy III a tak aj funguje - výrazne zlepšuje procesivitu DNA polymerázy δ. DNA polymeráza δ má schopnosť 3'-5' exonukleázovej aktivity a pri replikácii sa podieľa na syntéze vedúceho aj oneskorujúceho sa vlákna.[5]
DNA polymeráza ε
upraviťDNA polymeráza ε v niektorých prípadoch nahradzuje DNA polymerázu δ, predovšetkým pri oprave DNA a pravdepodobne aj pri 5'-3' exonukleázovej aktivite, pri ktorej odbúrava primery (podobne ako prokaryotická DNA polymeráza I).[5]
Reverzná transkriptáza
upraviťReverzná transkriptáza je RNA závislá DNA polymeráza, ktorá syntetizuje nové vlákno DNA komplementárne k existujúcemu vláknu RNA. Navyše má schopnosť odbúravať RNA vlákno, ktoré je komplementárne spárované k DNA vláknu. Reverznú transkriptázu využívajú retrovírusy na prepis svojej RNA do DNA, ktorú následne začleňujú do genómu hostiteľskej bunky. Ide napríklad o vírus hepatitídy B alebo HIV.
Využitie vo výskume
upraviťDNA polymeráza je jeden z najdôležitejších enzýmov, ktoré sú vedecky využívané pri práci s DNA, konkrétne pre jej amplifikáciu, klonovanie a sekvenáciu. Pre účely molekulárnej biológie boli izolované termostabilné DNA polymerázy, predovšetkým z bakteriálnych a archeálnych organizmov žijúcich v morských hlbinách. Tieto DNA boli pre vedecké účely ďalej modifikované mutáciami, aby bola ich aktivita zlepšená v prospech daného účelu. Doposiaľ najväčšie využite nachádzajú DNA polymerázy v tzv. polymerázovej reťazovej reakcii (PCR), vďaka ktorej môžu vedci amplifikovať z jednej molekuly templátovej DNA ľubovoľný úsek DNA.[5]
Referencie
upraviť- ↑ DNA polymeráza. In: Encyclopaedia Beliana 3, S. 437
- ↑ DNA-polymeráza. In: Malá slovenská encyklopédia 1993, S. 159
- ↑ Anglicko-slovenský slovník medicíny, 1998, S. 436
- ↑ polymeráza. In: Malá encyklopédia biológie, 1975, S. 389
- ↑ a b c d e f g h i j k l NELSON, David L.; COX, Michael M.. Lehninger Principles of Biochemistry. 6. vyd. New York : W. H. Freeman and Company, 2013. ISBN 978-1-4641-0962-1. (anglicky)
- ↑ KOLEKTÍV AUTOROV. Biochemie - Základní kurz. 3. vyd. Praha : Učební texty Univerzity Karlovy v Praze, 2000. (česky)
- ↑ KAGUNI, L. S.. DNA polymerase gamma, the mitochondrial replicase. Annual review of biochemistry, 2004, s. 293-320. (anglicky)