Biuretski test
Biuretski test (biuretska reakcija) ali Piotrowskijev test je kvalitativni kemijski test, ki se uporablja za dokazovanje prisotnosti peptidnih vezi, značilnih za beljakovine. V prisotnosti beljakovin bakrovi (II) ioni tvorijo rožnato obarvan kompleks.[1][2][3][4] Metoda je svoje ime dobila po snovi, ki se imenuje biuret (H2NCONHCONH2), in nastaja ob segrevanju sečnine.[5] Na Poljskem je biuretski test v čast poljskemu fiziologu Gustawu Piotrowskijevemu, ki je metodo opisal leta 1857, poznan tudi pod imenom Piotrowskijev test.[6][7] Pri reakciji se bakrovi (II) ioni vežejo z atomi peptidne vezi (skupina -CONH-).[8][9]
Iz osnovne različice so razvili več različic tega testa.[10] Biuretski test je najprimernejši za analiziranje tkivnih delcev, v katerih je visoka koncentracija beljakovin, saj je neobčutljiv za prisotnost prostih aminokislin (te nimajo peptidne vezi, ki se vzpostavi komaj s povezavo dveh aminokislin v dipeptid[11][8]).[9][5] Med aminokislinami je izjema histidin, ki prav tako daje pozitivno reakcijo.[12][3][7] Pogosto se testa poslužujejo v analitski biomedicini pri dokazovanju beljakovin v urinu (seču).[7][13][14]
Postopek
urediVodni raztopini izbranega vzorca se doda enaka prostornina 1-odstotne baze (na primer natrijevega ali kalijevega hidroksida), ki tekočino naredi alkalno[3], nakar se v tako pripravljeno raztopino kane nekaj kapljic v vodi raztopljenega bakrovega (II) sulfata (CuSO4).[15] Raztopina se zatem zmeša.[3]
Ob prisotnosti beljakovin v vzorcu (in posledično tudi peptidnih vezi) se raztopina obarva rožnato do vijolično.[15] Večja intenziteta barve pokaže na večje število kompleksov, ki so nastali s povezavami med peptidnimi vezmi in bakrom, pa tudi na večje število peptidnih vezi v vzorcu.[8][7][16] Negativna reakcije ne povzroči spremembe barve.[3]
Po nekaterih podatkih je test zanesljiv pri vsebnosti beljakovin 0,0100 – 5,00 mg/mL.[17] Za učinkovito dokazovanje peptidnih vezi z opisanimi reagenti so nujni peptidi, ki so dolgi vsaj tri aminokisline (tripeptidi) in tako vsebujejo vsaj dve peptidni vezi.[8][15][18] S takšno raztopino reagirajo tudi različni pufri (denimo amonijak)[9], ki preprečijo normalen potek testa. Učinke amonijevih in magnezijevih ionov je mogoče izničiti z uporabo večjih količin alkalij.[3][7]
Biuretski test se lahko uporablja tudi kot kvantitativna metoda, pri čemer se koncentracije beljakovin v vzorcu meri s spektrofotometričnimi analizami.[8][4][7] Metoda temelji na načelu, da je absorpcija nastalega obarvanega kompleksa sorazmerna s količino beljakovin v merjenem vzorcu.[19]
Biuretski reagent
uredi
Biuretski reagent vsebuje natrijev hidroksid (NaOH) ali kalijev hidroksid (KOH) in hidriran bakrov (II) sulfat, ki se jima doda tudi kalijev natrijev tartrat, namenjen stabilizaciji bakrovih ionov (pravimo, da je tako imenovan kelat[3]) in večanju njihove topnosti.[8][19][20][21] Reagent je zaradi bakrovih ionov obarvan modro (takšne barve ostane tudi vzorec, ki ima negativno reakcijo na biuretskem testu).[22]
Kemizem testa
urediV alkalni raztopini modro obarvani bakrovi (II) ioni tvorijo kompleks s peptidnimi vezmi beljakovin. Te imajo namreč na mestu dušika neparjene elektronske pare, k reakciji pa pripomore tudi kisik vodne molekule. Zaradi tega pride do nastajanja rožnato (vijolično) obarvanega kompleksa med Cu2+ ioni in skupinami atomov peptidne vezi, C=O ter =NH.[8][7]
Ker test daje pozitivno reakcijo na vsako spojino, ki vsebuje vsaj dve karbonilni skupini (C=O), vezani na dušikov ali ogljikov atom, je treba za večjo zanesljivost izvesti tudi drugačne detekcijske metode.[22][23]
Glej tudi
urediSklici
uredi- ↑ »Definition of biuret | Dictionary.com«. www.dictionary.com (v angleščini). Pridobljeno 11. marca 2021.
- ↑ The reaction was first observed 1833: Ferdinand Rose (1833) "Über die Verbindungen des Eiweiss mit Metalloxyden" (On the compounds of albumin with metal oxides), Poggendorfs Annalen der Physik und Chemie, vol. 104, pages 132-142, DOI: 10.1002/andp.18331040512. It was independently rediscovered in 1857 by a Polish physiologist: G. Piotrowski (1857) "Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge" (A new reaction of proteins and their related derivatives) Sitzungsberichte der Kaiserliche Akademie der Wissenschaften in Wien, mathematisch-naturwissenschaftliche Classe (Proceedings of the Imperial Academy of Philosophies in Vienna, mathematical-natural sciences section), vol. 24, pages 335-337.
- ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 Karki, Gaurab (20. april 2018). »Biuret test-Principle, Requirements, Reagents, Preparation, Procedure and Result«. Online Biology Notes (v ameriški angleščini). Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ 4,0 4,1 »PROTEINS | Physiological Samples« (v angleščini). 1. januar 2005. str. 357–375. doi:10.1016/B0-12-369397-7/00494-5.
{{navedi revijo}}: Sklic magazine potrebuje|magazine=(pomoč) - ↑ 5,0 5,1 »biuret test«. Oxford Reference (v angleščini). doi:10.1093/oi/authority.20110803095509834. Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ Dr. G. von Piotrowski (1857). »Eine neue Reaction auf Eiweisskörper und ihre näheren Abkömmlinge«. Sitzungsberichte der Kaiserlichen Akademie der Wissenschaften. Mathematisch-Naturwissenschaftliche Classe. 24: 335–337.
- ↑ 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 »Biuret Test«. VEDANTU (v angleščini). Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ 8,0 8,1 8,2 8,3 8,4 8,5 8,6 »Biuret Test for Protein | Biochemistry«. Microbe Notes (v ameriški angleščini). 4. maj 2020. Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ 9,0 9,1 9,2 Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee (2009). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. Wiley. str. 111. ISBN 978-0470087664.
- ↑ “Chemistry of Protein Assay” Thermo Scientific Protein Methods Library. http://www.piercenet.com
- ↑ »Peptide bond formation«. www.mun.ca. Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ »Reaction of histidine with the biuret reagent in the presence of oxygen«. Analytical Biochemistry (v angleščini). Zv. 6, št. 1. 1. julij 1963. str. 1–12. doi:10.1016/0003-2697(63)90002-2. ISSN 0003-2697.
- ↑ Savory, John; Pu, Pin H; Sunderman, F William, Jr. (1. december 1968). »A Biuret Method for Determination of Protein in Normal Urine«. Clinical Chemistry. Zv. 14, št. 12. str. 1160–1171. doi:10.1093/clinchem/14.12.1160. ISSN 0009-9147.
- ↑ Guobing, Xu; Lili, Jiao; Lihua, Zhu; Tiean, Xia (2001). »Application of an improved biuret method to the determination of total protein in urine and cerebrospinal fluid without concentration step by use of Hitachi 7170 auto-analyzer«. Journal of Clinical Laboratory Analysis (v angleščini). Zv. 15, št. 4. str. 161–164. doi:10.1002/jcla.1020. ISSN 1098-2825. PMC 6807869. PMID 11436195.
- ↑ 15,0 15,1 15,2 Fenk, C. J.; Kaufman, N.; and Gerbig, D. G. J. Chem. Educ. 2007, 84, 1676-1678.
- ↑ »2.9: Proteins«. Biology LibreTexts (v angleščini). 19. julij 2019. Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ Janairo, G.; Linley, Marianne S.; Yap, L.; Llanos-Lazaro, Nancy; Robles, Julita C. (2015). »Determination of the sensitivity range of biuret test for undergraduate biochemistry experiments«. undefined (v angleščini). Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ »protein determination by the biuret method«. www.ruf.rice.edu. Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ 19,0 19,1 »Spectrophotometry | Biochemical Applications« (v angleščini). 1. januar 2019. str. 205–213. doi:10.1016/B978-0-12-409547-2.00501-1.
{{navedi revijo}}: Sklic magazine potrebuje|magazine=(pomoč) - ↑ »Chemical Reagents«. Arhivirano iz prvotnega spletišča dne 13. februarja 2010. Pridobljeno 30. januarja 2010.
- ↑ Datta, S. P.; Leberman, R.; Rabin, B. R. (1959). »The chelation of metal ions by dipeptides and related substances. Part 5.—Cupric complexes of sarcosyl and leucyl ligands«. Trans. Faraday Soc. (v angleščini). 55: 2141–2151. doi:10.1039/TF9595502141. ISSN 0014-7672.
- ↑ 22,0 22,1 »Biuret test - Definition and Examples - Biology Online Dictionary«. Biology Articles, Tutorials & Dictionary Online (v ameriški angleščini). 3. oktober 2020. Pridobljeno 11. maja 2021.
- ↑ »Organic Chemistry 3510, Proteins and Amino Acids«. people.uwplatt.edu. Arhivirano iz prvotnega spletišča dne 13. aprila 2021. Pridobljeno 11. maja 2021.